Sluit onderwerp opties

Ik heb een vraag,kunnen jullie me helpen?(speciaal vraag 3)

Alvast bedankt

Een skliniek heeft een glycerolstock ter beschikking gesteld van een BL21DE codon+ Esscherichia. coli bacterie stam (Strategene) met de pET15b - TNFα vector (Novagen). Bij deze vector staat de expressie van TNFα onder controle van een T7 promoter. T7 RNA polymerase wordt geleverd door E. coli BL21DE waarin dit T7 RNA polymerase gen onder controle van een lac promotor is geplaatst. Na IPTG inductie vindt expressie van dit T7 RNA polymerase plaats. De toevoeging codon+ houdt in dat de BL21DE stam nog een plasmide (chloramphenicol resistentie) bij zich heeft. Dit "codon+" plasmide codeert voor een aantal tRNAs waardoor je geen last meer hebt van de codon bias. Het pET15b plasmide heeft overigens een ampicilline resistentie (b-lactamase gen).

De vector die we gekregen hebben van die kliniek stelt ons in staat om het eukaryotische TNFα te produceren in een prokaryotisch expressie model. Er zijn echter fundamentele verschillen in de synthese van een eiwit tussen prokaryoten en eukaryoten. Om een goed beeld te hebben van de mogelijkheden en limitaties van het gebruikte expressie model ga je in groepen van 4 een literatuuronderzoek uitvoeren naar:

De verschillen in eiwitsynthese tussen prokaryoten en eukaryoten.
Hoe wordt TNFa in eukaryoten een actief eiwit

De gevolgen van productie van een eukaryotisch eiwit in een prokaryoot expressiemodel.
- 1) Kun je ongelimiteerd eukaryotisch eiwit produceren in een prokaryotisch expressie systeem?

- 2)Wat is de succeskans van de productie van een eukaryoot eiwit in een prokaryoot?

- 3) Wat doet een cel als het geproduceerde eiwit verkeerd is gevouwen of als het toxisch is voor de cel?

Tot op zekere hoogte kan dit, met dit systeem kan je na de inductie met IPTG een zoveel expressie krijgen dat je expressie eiwit ongeveer 50% van het totaal eiwit uitmaakt. Ik heb het systeem nooit gebruikt, maar ik denk wel dat de groei van je bacterie hierdoor sterk afneemt/stopt. Je moet dus denk ik eerst voldoende bacterie hebben en daarna pas je eiwit van interesse induceren met IPTG.

Dat hangt geheel af van het eiwit, eiwitten die post-translationale modificaties nodig hebben voor de functie (glycosylering, lipidemodificatie etc.) zijn meestal niet functioneel. Ook hebben veel eiwitten chaperone eiwitten (vouw-eiwitten) nodig na de translatie om in de correctie structuur te worden gevouwd, een eiwit waar ik mee heb gewerkt heeft bijvoorbeeld een WD40 domein en dit kan niet op de juiste manier worden gevouwen in bacteriën, in dit geval kan je insect cellen gebruiken met behulp van baculovirus transfectie.
Dit is voor ieder eiwit anders, kleine eiwitten zoals bijvoorbeeld actine en tubuline, die in hoge concentratie in cellen aanwezig zijn kunnen bijvoorbeeld niet in bacterien tot expressie worden gebracht.

Eiwitten die niet correct worden gevouwen zijn meestal niet oplosbaar en komen meestal terecht in "inclusion bodies". Dit zijn een soort van aggregaten waarin al het eiwit zit gestopt en deze zijn vaak toxisch voor de cel. Wat ze er vervolgens mee doen weet ik niet, dit kan denk ik in het geval van bacteriën soms kunnen worden uitgescheiden, maar in bijvoorbeeld eukaryotische cellen is dit cytotoxisch en zal dit vaak leiden tot celdood.
Een pathologisch voorbeeld van verkeerd gevouwen/eiwit aggregaten zijn diverse neurodegenratieve ziektes, zoals Parkinson, Huntington's, Alzheimer. Bij deze ziektes hopen verkeerd gevouwen eiwitten op in neuronen en resulteren ze in celdood waardoor de hersenen langzaam afsterven.

Mocht je het nog niet weten/gevonden hebben, maar na een snelle google search zie ik trouwens dat het mogelijk is om TNFa tot expressie te brengen in bacteriën.

http://www.biomyx.net/TNFa

Hartelijk bedankt voor je beantworden,

Ik heb het gesnapt,maar dat is echt moeilijk onderwerp